吸出原培養液；

加入2mL左右PBS，輕輕晃動培養瓶潤洗細胞，吸出PBS丟棄；

加入1mL左右胰酶，輕輕晃動培養瓶使之浸潤所有細胞；

放入培養箱消化，消化3-5分鐘（根據具體細胞稍作延長或縮短），顯微鏡下看到細胞開始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動培養瓶使細胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細胞；

吸出培養瓶內的PBS和細胞懸液，轉移到無菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養基終止消化并吹散細胞，使細胞盡量呈單顆細胞的懸浮液；

原培養瓶中加入0.5mL胰酶，晃動培養瓶浸潤細胞，放入培養箱繼續消化，直到細胞塊中間全部收縮變圓，晃動培養瓶可脫落；

用3mL含血清的培養基終止消化，將瓶底的細胞全部吹下，并輕輕吹吸分散細胞呈單顆；

收集細胞懸液與第一次消化下來的細胞合并到一個離心管；

離心收集細胞沉淀，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄；

加入新鮮培養基，吹打幾下混勻細胞，按需接種到新培養瓶，補足培養基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進行培養；

檢查培養箱二氧化碳，溫度和水盤。