本試劑盒針對大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cells, EPCs）的分離與培養(yǎng)設(shè)計(jì)，提供從骨髓采集到原代細(xì)胞擴(kuò)增的全流程解決方案。內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生、缺血組織修復(fù)及心血管疾病研究中具有重要價(jià)值，本產(chǎn)品通過優(yōu)化試劑配方與操作流程，可高效獲取高活性、高純度的EPCs，適用于血管生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)及藥物篩選等領(lǐng)域。

產(chǎn)品組成

試劑盒包含以下核心組件，所有組件均標(biāo)注規(guī)格（3Tests/10Tests）、儲存條件及有效期：

• 大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞專用清洗液
  規(guī)格：3Tests（250 mL）；10Tests（500 mL×2）
  儲存條件：2-8℃
  有效期：12個(gè)月
  功能：含緩沖體系與抗生素，清除骨髓樣本中的血液成分及雜質(zhì)，減少污染風(fēng)險(xiǎn)。

• 大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞專用裂解液
  規(guī)格：3Tests（15 mL）；10Tests（50 mL）
  儲存條件：2-8℃
  有效期：12個(gè)月
  功能：特異性裂解紅細(xì)胞，保留白細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞，提升目標(biāo)細(xì)胞純度。

• 大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基
  規(guī)格：3Tests（100 mL）；10Tests（300 mL）
  儲存條件：2-8℃
  有效期：12個(gè)月
  功能：含氨基酸、維生素及無血清成分，維持細(xì)胞基礎(chǔ)代謝需求。

• 大鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞添加劑
  規(guī)格：3Tests（10 mL）；10Tests（30 mL）
  儲存條件：-5~-20℃
  有效期：12個(gè)月
  功能：含重組人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）及抗氧化劑，促進(jìn)EPCs增殖與血管內(nèi)皮表型維持。

• 70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)
  規(guī)格：3Tests（3個(gè)）；10Tests（10個(gè)）
  儲存條件：常溫
  有效期：36個(gè)月
  功能：過濾骨髓碎片及未消化組織，獲得單細(xì)胞懸液。

實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

自備器材：

• 手術(shù)器械（眼科剪×3、直鑷×3、彎鑷×3）、2 mL注射器、6 cm/10 cm培養(yǎng)皿、T25培養(yǎng)瓶、泡沫解剖板、注射器針頭（18G-22G）、15 mL/50 mL離心管。

預(yù)處理建議：

• 正式實(shí)驗(yàn)前使用1-2只正常大鼠進(jìn)行骨髓采集模擬訓(xùn)練，優(yōu)化沖洗與過濾操作速度。

操作步驟

1. 骨髓采集與清洗 

• 解剖取大鼠股骨與脛骨，用2 mL注射器吸取預(yù)冷清洗液，通過針頭反復(fù)沖洗骨髓腔至骨骼發(fā)白，收集骨髓懸液。

• 4℃離心（300g，5min），棄上清，重復(fù)清洗1次以去除脂肪與血液成分。

2. 紅細(xì)胞裂解 

• 加入預(yù)溫至37℃的裂解液，輕柔吹打混勻后靜置5min，終止裂解反應(yīng)。

• 4℃離心（300g，5min），棄上清，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

3. 過濾與接種 

• 細(xì)胞懸液經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾，去除骨碎片與細(xì)胞團(tuán)塊，收集濾液。

• 計(jì)數(shù)后調(diào)整密度至1×10? cells/mL，接種至T25培養(yǎng)瓶，添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑（體積比100:1）。

4. 培養(yǎng)與鑒定 

• 置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34?/VEGFR2?細(xì)胞比例（>85%為合格）。

注意事項(xiàng)

1. 骨髓沖洗技巧 

• 使用18G針頭可提高沖洗效率，避免過度用力導(dǎo)致骨髓稀釋。

2. 裂解時(shí)間控制 

• 過度裂解會損傷EPCs，建議通過顯微鏡觀察懸液顏色（由紅色變?yōu)榈凵珪r(shí)終止）。

3. 添加劑使用 

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑需現(xiàn)用現(xiàn)混，避免光照降解生長因子。

常見問題解答

Q1：培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁率低如何處理？
A：檢查培養(yǎng)基是否漏加添加劑，或嘗試在接種時(shí)添加纖連蛋白（5μg/cm2）促進(jìn)貼壁。

Q2：如何區(qū)分內(nèi)皮祖細(xì)胞與成熟內(nèi)皮細(xì)胞？
A：內(nèi)皮祖細(xì)胞呈圓形或簇狀生長，可檢測其攝取乙酰化低密度脂蛋白（DiL-Ac-LDL）的能力及管腔形成潛能。

儲存與運(yùn)輸

• 低溫組件（裂解液、添加劑）：冰袋運(yùn)輸，收到后立即存于-20℃。

• 常溫組件（濾網(wǎng)）：干燥避光保存。

• 開封后建議：清洗液與基礎(chǔ)培養(yǎng)基4℃保存并于2周內(nèi)用完；裂解液與添加劑分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品優(yōu)勢
? 專用配方：針對EPCs生物學(xué)特性設(shè)計(jì)，兼顧細(xì)胞活性與純度
? 操作簡化：預(yù)分裝試劑減少配制步驟，2小時(shí)內(nèi)完成從取材到接種
? 性能驗(yàn)證：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)與功能實(shí)驗(yàn)（管腔形成）雙重質(zhì)控，確保細(xì)胞質(zhì)量